Este artículo recoge la conferencia impartida por la Dra. Sara Borrell, del equipo de Registros de Biovet, en el XXXI Simposium Internacional de Biovet en Tarragona, durante la cuarta sesión dedicada a las enzimas y los captadores de micotoxinas, que tuvo lugar el día 29 de mayo de 2018. Bajo el título, “Enzimas proteasas. Revisión e importancia económica” la conferencia profundizó en el estudio de las proteasas describiendo los diferentes tipos, el mecanismo de acción, los métodos de análisis y usos, etc. La veterinaria del equipo de Biovet S.A, Dra. Maria Soriano, ha realizado la adaptación de la ponencia.

ENZIMAS: Definición, unidades y clasificación

En toda reacción química existen diferentes reactivos (A + BC) transformados posteriormente en diferentes productos (AB + C), que constan de un paso intermedio llamado estado de transición o estado de activación (A-B-C), en el que los enlaces de los reactivos se encuentran debilitados para poder ser modificados. Este estado de transición posee una energía superior a la de los reactivos y a la de los productos, por lo que es necesario un aporte energético llamado energía de activación (Ea) para que la reacción se lleve a cabo.

Las enzimas son biocatalizadores eficientes y específicos que impulsan estas reacciones biológicas, aumentando la velocidad de reacción por disminución de la energía de activación (Imagen 1). Estos catalizadores permiten, a bajas cantidades y sin consumirse, alcanzar el equilibrio de la reacción química más fácilmente sin alterar el resto de los parámetros energéticos de la reacción.

Las reacciones enzimáticas son regulables y la mayoría de las enzimas son proteínas.

Imagen 1: Diferencia en el progreso de las reacciones químicas y la energía de activación

necesaria usando una enzima (color rojo) o sin su aplicación (color naranja).

La actividad enzimática se mide según la velocidad de desaparición del substrato o la velocidad de aparición del producto. La actividad enzimática puede expresarse en:

• Unidades internacionales de actividad enzimática (UI): en referencia a la cantidad de enzima necesaria en condiciones óptimas de temperatura, pH y fuerza iónica para transformar 1 µmol de sustrato por minuto.
• Katal: en relación a la cantidad de enzima que se requiere en condiciones óptimas para transformar 1 mol de sustrato por segundo. La equivalencia entre ambas unidades es de: 6×10⁷ IU = 1 katal.

En el ámbito industrial no suelen utilizarse estas unidades y, por ejemplo, en el caso de las proteasas, existen diversas unidades aceptadas en el ejercicio práctico, tales como: unidades King- Amstrong, unidades Bodansky, unidades Somogyi o unidades Anson. Estas últimas unidades, las unidades Anson para la actividad peptídica, describen la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1 mmol de tirosina con hemoglobina como sustrato en 10 minutos, correspondiendo 1 unidad Anson a 550 UI.

Las enzimas se clasifican de acuerdo con la Comisión de enzimas con la nomenclatura “EC a.b.c.d”, donde:

• a: Clase, relacionado con la reacción que se cataliza (Tabla 1)
• b: Subclase
• c: Sub-subclase
• d: Número de serie de la sub-subclase

Tabla 1 – Principales clases de enzimas dependiendo la reacción que catalizan.

PROTEASAS: Tipos, mecanismo de acción, métodos de análisis y usos

Para poder obtener los aminoácidos esenciales presentes en la dieta, normalmente incluidos en proteínas más complejas, es necesario descomponerlas mediante el uso de enzimas específicas, llamadas proteasas.

De acuerdo con la Comisión de Enzimas, las proteasas se incluyen en el grupo 3 de hidrolasas porque su mecanismo de acción es la ruptura de los enlaces peptídicos de las proteínas mediante el uso de una molécula de agua, obteniendo como productos péptidos más sencillos o aminoácidos (Imagen 2).

Imagen 2 – Proceso de hidrólisis llevado a cabo por una proteasa.

Las proteasas se clasifican según diversos criterios como:

• Origen: animal, vegetal, bacteriano o fúngico.
• Modo de acción catalítico: actividad endógena o exógena, dependiendo de si rompen los enlaces peptídicos situados en los extremos o en el interior de la cadena peptídica.
• Según el aminoácido presente en centro activo, encargado de catalizar la reacción:
  • Serina proteasas
  • Cisteína proteasas
  • Aspartato proteasas
  • Metaloproteasas

El centro activo de la enzima es el lugar por donde se une el sustrato y donde tiene lugar la catálisis de la reacción (Imagen 3). El centro activo es de tamaño muy pequeño respecto al tamaño total del enzima y está compuesto por una cadena lateral de aminoácidos que se unen al producto y una cadena lateral de aminoácidos que realizan la catálisis.

Imagen 3 – Centro activo de una enzima.

Para explicar con más detalle como realizan el proceso de hidrólisis las proteasas, se muestra como ejemplo el mecanismo de acción de una serina proteasa (Imágenes 4, 5, 6, 7 y 8).

MECANISMO DE ACCIÓN DE UNA SERINA PROTEASA

El mecanismo de acción de una serina proteasa consiste en una fase de acilación en la que se forma un intermediario covalente acil-enzima, con liberación del primer producto, y una fase de desacilación en la que una molécula de agua rompe el intermediario con liberación del segundo producto.

El espacio de color negro en las imágenes es la representación del centro activo de la enzima, donde aparecen inicialmente (Imagen 4):

• La tríada de los tres aminoácidos unidos, que son serina (Ser 195), histidina (His 57) y aspartato (Asp 102), común en todos los centros activos de las serinas proteasas.
• La proteína que va a ser hidrolizada, presente en la parte inferior izquierda de la imagen.

Imagen 4: Mecanismo de acción de una serina proteasa – Imagen inicial.

La acción catalítica comienza cuando His 57 retira un protón del grupo alcohólico de la serina, quedando la histidina con carga positiva y la serina con carga negativa. Esta serina es la que se relaciona inicialmente con la proteína, atacando al grupo carbonilo (C=O) del enlace escindible, y dando lugar al Estado de transición 1 (fase de acilación, imagen 5).

Imagen 5: Mecanismo de acción de una serina proteasa – Fase de acilación.

A continuación, la histidina 57 cede su protón a este complejo, con lo que se separa el primer producto (NH₂-R) y el complejo queda como Acilenzima (Imagen 6), listo para comenzar la segunda fase de la reacción.

Imagen 6: Mecanismo de acción de una serina proteasa – Acilenzima.

La segunda fase de la reacción tiene lugar por la entrada de una molécula de agua (el segundo substrato) al centro activo. La histidina 57 retira entonces un protón de la molécula de agua, que queda convertida en un ion hidroxilo (OH^–) unido a la acilenzima y la serina (Imagen 7).

Imagen 7: Mecanismo de acción de una serina proteasa – Acilenzima + Hidroxilo.

El grupo hidroxilo ataca nuevamente al enlace carbonilo, produciendo el segundo estado de transición, que se resuelve con la salida del producto 2. Por último, la histidina cede su protón a la serina, con lo cual tiene lugar la vuelta al estado inicial del centro activo (Imagen 8).

Imagen 8: Mecanismo de acción de una serina proteasa – Imagen final.

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Existen tres métodos para la cuantificación de enzimas:

• ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): Basado en la capacidad del enzima para unirse a un sustrato, en este caso anticuerpos. Esta unión dará lugar a un producto coloreado, así que la intensidad de color es proporcional a la cantidad de enzima.

Imagen 9:  Tipos de ELISA: Directo e indirecto.

• ELECTROFORESIS: Técnica basada en la separación de moléculas en base a su tamaño y su carga eléctrica. Consiste en un gel (de agar o poliacrimida) colocado en una cámara sometida a una diferencia de potencial causada por un cátodo (terminal con carga negativa) y un ánodo (terminal con carga positiva) en los lados opuestos de la cámara. El campo eléctrico que se crea provoca la migración de las moléculas: moléculas grandes y pesadas migrarán más lentamente que moléculas pequeñas y ligeras.

Imagen 10: Resultados de una prueba de electroforesis.

• ESPECTROFOTOMETRÍA: Se basa en el principio de formación de un complejo coloreado cuando contactan enzima y sustrato en presencia de los reactivos adecuados. La absorbancia emitida por este complejo se mide y permite realizar una recta de calibración con los patrones de la enzima.

Imagen 11: Cubetas ópticas para valoración en espectrofotómetro.

Tabla 2: Resultados de concentración respecto a las absorbancias obtenidas.

USOS

La proteína de origen animal se ha convertido en un elemento de la dieta con un elevado costo y con muchas fluctuaciones en el suministro. Por ello, la proteína vegetal se ha convertido en la fuente alternativa, especialmente las legumbres, compuestas por proteína de alta calidad, vitaminas, fósforo y hierro, con la desventaja de contener factores antinutricionales como los inhibidores de proteasas, que interfieren en el uso digestivo y metabólico de las proteínas de la dieta o los inhibidores de glicosidasas, especialmente la α-amylasa de la soja.

Al aumentar el uso de la proteína de origen vegetal, se ha extendido la inclusión de proteasas en la dieta. El uso de una proteasa eficiente permite:

• Mejorar la digestibilidad de las proteínas y los aminoácidos de la dieta, que se refleja en un mejor índice de conversión, en una disminución de la excreción de nitrógeno al medio ambiente y una reducción de los casos de clostridiosis intestinal.
• Compensar los factores antinutricionales.

La selección de la proteasa en la dieta debe tener como consideraciones:

• La especie de destino.
• La especificidad por un sustrato a mayor rango de acción.
• Las condiciones fisiológicas: por ejemplo, el pH en los diferentes tramos digestivos.
• La encapsulación de las semillas vegetales.
• La estabilidad durante la fabricación, y su resistencia al calor durante el procesado.
• La sinergia con otras enzimas usadas.

IMPORTANCIA ECONÓMICA

Las proteasas generaron unas ventas de 150 millones de dólares en 2016, lo que supone un 15% del total del mercado de las enzimas. La Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE) prevé un crecimiento del mercado de este tipo de enzimas para los próximos años, a nivel mundial alrededor de los 1280 millones USD en 2019 y de los 2000 millones USD para 2024.

Gráfico 1: Evolución prevista para las vendas mundiales de proteasas en los próximos años (Fuente: OCDE)

CONCLUSIONES

La demanda creciente de proteínas y aminoácidos necesarios en la dieta de animales de producción para alcanzar las conversiones que la industria necesita es un factor clave para soportar la penetración de las proteasas en los mercados de enzimas.

Mejorar la eficiencia de la alimentación manteniendo la salud intestinal es la propiedad más beneficiosa de las proteasas.